（一）菌種退化的現象

　　1．在形態上

　　例如霉菌發生孢子減少甚至不生孢子，或霉叢色澤的明顯變化等。

　　2．生理上

　　如霉菌淀粉酶活力下降，酵母生長緩慢及發酵力下降等．應該指出，若由于培養基的改變或因工藝條件的不當，以及污染雜菌等使菌種顯示其性能低下的現象，則不能視為退化，因為這些暫時的外界原因一經消除，菌種原有的性能即可恢復。因此，必須識別所謂退化的假象，正確地判斷菌種是否退化，以便采用適當的措施，加以防治。

　　（二）菌種退化的原因

　　菌種退化的主要原因是其基因的負突變，若控制生產性狀的有關基因發生負突變，則可使菌種的生產性狀嚴重劣化。例如控制產品產量的基因發生負突變，則會使產量下降；若控制霉菌孢子生成的基因發生負突變，則會使菌種產孢子的能力下降。

　　1．移殖代數的增加

　　一個經常處于旺盛生長狀態的菌體細胞，發生基因負突變的幾率，要比處于休眠狀態的細胞大得多，而且在實際生產中，菌種的培養基及培養和發酵的條件是因批而異的，如果環境有利于負突變細胞增殖，則菌種的群體細胞經多次移植后，退化的細胞會很快占優勢，使退化的性狀明顯起來。

　　2．菌種篩選方法不當

　　在菌種篩選中，往往在初篩時產量較高，但隨著復篩的進行，則因產量逐步下降而被淘汰，這在霉菌篩選中更為多見。因為菌落若由一個以上的孢子或細胞繁殖而成，而其中只有一個高產的正突變孢子或細胞，則傳代的結果必然是高產的菌體數量逐漸減少而使產量下降；若菌落確由一個孢子或細胞組成，但此菌為多核細胞，則在一次突變中幾個核變異狀況各異，隨著代數的增加，因核的分離會使菌體性狀呈現多元化，產量也隨之而變，即使為單核孢子，若在雙鏈的DNA上只有一條鏈上的某個部位發生突變，則在不斷的移殖過程中，也會產生性狀分離而形成群體不純，為盡可能地降低上述現象產生的幾率，應采取得當的菌種選育手段。

　　3．培養及保存條件的影響

　　這種影響可由自發突變率來反映，也可在基因不變的情況下顯示。在自發突變方面，例如培養或保存時間長，則對菌種的有毒害作用的成分積累較多而引起的突變率也較高。溫度升高也會使菌株和突變率增加。培養基中某些成分的缺乏，也可促進野生型回復突變株的生長占據優勢。

　　4．基因不產生突變而菌種退化的原因

　　例如某種曲霉若以分生孢子傳代，則所產子囊孢子的數量逐漸減少。最終呈現不產子囊孢子的“突變”；但若用子囊孢子傳代，則生成分子孢子的數量逐漸減少。這種狀況下可用形成異核體的事實加以說明。若將黃色分生孢子的突變株，用子囊孢子多次傳代，則可得到很少產分生孢子的黃色菌株；而將另一產生綠色分生孢子的野生株，多次以分生孢子傳代，則可得到不產子囊孢子的綠色菌株，若將上述二株退化菌株裝接于一起培養，則可得到1株既能產子囊孢子，又能產很多分生孢子的菌株，即表明形成了新的異核體。考察該異核體的分生孢子或子囊孢子重新分離的性狀，若上述退化現象是由基因突變而造成的、則重新分離所得的黃色菌株，應產分生孢子很少，綠色菌株應不形成子囊孢子。但事實上分離的結果是這兩個菌株均能產子囊孢子，且生成大量分生孢子，這表明上述退化性狀并非由基因突變所致。這類退化現象的原因尚未十分明了。

　�。ㄈ�）菌種退化的防治

　　（1）菌種選育要得法例如加強分離純化；使用單核菌株進行誘變；提高誘變劑量，使單核細胞DNA雙鏈中的一條鏈有某一點位產生突變，而另一條則完全喪失作為模板復制的能力，以減少回復。

　　（2）防止基因自發突變從菌種的培養基和培養條件方面加以注意。例如產麥芽糖酶能力強的酵母，用于白酒生產時出酒率較高；但若將其長期培養于葡萄糖培養基時，則產麥芽糖的能力會下降。若將其在液態麥芽汁中培養1~2代后，再接回到米曲汁試管斜面培養基上培養，則可有效地增強原有的能力。又如UV-11黑曲霉或UV -48黑曲霉菌株，采用察氏培養基培養時，開始幾代長勢良好，色澤正常，糖化力也可保持在5000~8000U;但繼續傳代后，相繼呈現菌膜增厚，褶皺增大，孢子稀疏，色澤變淡及糖化力下降等現象。即使對其進行誘變和篩選，也無明顯效果。但若采用下述固態試管斜面培養基，則可有效地防止這2種菌株的退化。即蔗糖3.0%，氯化鉀0.05%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.0001%，瓊脂2%，蒸餾水85%~90%，麩皮浸出液10%~15%。不難理解，如果產生糖化酶能力強的曲霉等，長期生長于葡萄糖培養基上，則生成糖化酶的能力必然退化，因其可不必分泌糖化酶而可直接利用葡萄

糖了。

　　(3)盡可能地減少傳代次數在每次轉接生產用的菌種時，應保證滿足一定生長期內的數量，以減少傳代次數。霉菌不要用菌絲傳代，而采用孢子傳代，或交替使用分生孢子和子囊孢子傳代，也可防止菌種退化。在一般條件下，斜面每移殖一代，酵母可保存三個月，霉菌、芽孢桿菌在低溫下可保藏半年左右，無芽孢桿菌可保藏一個月左右。

　　(4)分離純化在生產過程中，菌種的許多細胞或孢子的變化趨勢及程度是不可能相同的，大部分菌體可能隨著時間的推移而某些性能發生相對的退化。但有些菌體的某些主要特性可能會增加，故應經常將后一部分菌體分離出來；或在試管原菌中，將優良的細胞菌體分離出來。由于菌落及試管原菌的不純，有時還會污染雜菌，故定期進行單細胞分離純化是完全必要的。

　　(5)消除退化的假象例如在利用UV-11菌株制麩曲時，有的廠在工藝上忽視了它要求培養溫度較低，不應超過32℃的特點，品溫高達37—38℃，致使雜菌大量繁殖，但因曲表面有黃色掩蓋而誤為菌種退化。也有的廠片面地防止“水毛”，而忽視了UV-11要求水分偏高的特點，致使成曲孢子瘦小而色澤淺，萌發率低下，還有的不重視衛生和滅菌工作，在制曲過程中招致所謂白蟣子的腐敗菌的侵染，使成曲的糖化力很低，若缺乏理論知識和實際生產經驗，而將諸如上述的種種假象視為菌種退化，則必然貽誤生產的正常進行。

　�。ㄋ模┚�種的復壯

　　菌種的優良性狀的穩定是相對的，而變異是絕對的，生產上應用的菌種，在使用和保藏過程中，因外界條件和菌種內在因素的矛盾引起菌體的變異，可能發展到菌種的退化，發生某些形態和生理性能方面變化。如在斜面上發現黑曲霉孢子越傳代越少和菌種殘缺不齊等現象。酵母則發生細胞變形，生長緩慢或生產性能降低等，菌種的這種退化是由量變到質變的過程，當個體變異的數量達到一定程度時，菌種才能表現出退化現象。實踐證明，傳代次數越多，越易退化，因此在保藏菌種時盡量采取一些能夠較長時間保藏的方法，避免經常轉接，在退化現象出現后，要加以復壯，以恢復正常的生產性能。

　　既然菌種退化是在菌體退化細胞占相當數量后，所顯示的生產性能下降的現象，則完全有可能采取相應的措施予以復壯。

　　1．分離純化

　　將已退化的菌株用無菌生理鹽水制成懸濁液，并放入裝有無菌玻璃球的三角瓶中，放在搖床上振蕩20~30min，利用玻璃球的滾動，使菌體細胞均勻分散。再按通常的稀釋操作將菌液稀釋至10-4~10-6，分別做平板培養。然后挑取若干典型菌落，接到試管斜面培養基上培養，并分別做發酵試驗，從中選出優良菌株供生產用。因為自發突變使菌體退化是負突變，有時也會發生正突變，產生個別高產細胞，在復壯工作中獲取好菌株的可能性是存在的。

　　2．用高劑量的U．V．和低劑量MNNG聯合對退化菌株進行處理

　　以期得到發生正突變的優良菌株，或使負突變細胞回復。

　�。ㄎ澹┚�種的誘變

　　菌種的誘變是通過誘變劑處理提高菌種的突變幾率，擴大變異幅度，從中選出具有優良特性的變異菌株。誘變育種和其他育種方法比較，具有速度快、收效大、方法簡便等優點，前菌種選育的一種重要方法。在生產中應用得十分普遍。但是誘發突變缺乏定性，因此誘變突變必須與大規模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。以下分別敘述誘變育種工作流程和誘變育種工作中的三個重要環節：突變的誘發、突變株的篩選、突變基因的表達。

　　1．誘變菌種的流程

　　出發菌種（沙土管或冷凍管）→斜面（或肉湯培養24h）→單孢子懸液（或細菌懸液）→誘變處理（處理前后的孢子液或細菌懸液活菌計數）→涂布平板→挑取單菌落傳種斜面→搖瓶初篩→挑出高產斜面→留種保藏菌種→傳種斜面→搖瓶復篩→挑出高產菌株做穩定性試驗和菌種特性考察→放大試驗罐中試驗→大型投產試驗。整個流程按誘變過程和篩選過程兩部分說明如下：

　　(1)誘變過程由出發菌種開始，制出新鮮孢子懸浮液（或細菌懸浮液）做誘變處理，然后以一定稀釋度涂布平板，至平板上長出單菌落為止的各步驟為誘變過程。簡述如下：

　�、倬�種的斜面：出發菌種的斜面非常重要，其培養工藝最好是經過試驗已知的最佳培養基和培養條件，要選取對誘變劑最敏感的斜面種齡，要求孢子數量適中。

　　②單孢子懸浮液制備。

　�、坻咦佑嫈担赫T變處理前后的孢子懸液要孢子計數，以控制孢子懸液的孢子數和統計誘變致死率。常用于誘變處理的孢子懸液濃度為l05~l08個孢子/mL。孢子計數采用血球計數法在顯微鏡下直接計數。誘變致死率采用平板活菌計數來測定。

　�、軉尉�落分離：平皿內傾入20mL左右的培養基，凝固后，加入一定量經誘變處理的孢子液（以控制每一平皿生長10~50個菌落為合適的量），用刮棒涂布均勻后進行培養。

　　(2)篩選過程誘變處理的孢子，經單菌落分離長出單菌落后，隨機挑選單菌落進行生產能力測定，每一被挑選的單菌落傳種斜面后，在模擬發酵工藝的搖瓶中培養，然后測定其生產能力，篩選過程主要包括傳種斜面、菌株保藏和篩選高產菌株這三項工作。

　　誘變形成的高產菌株的數量往往小于篩選的實驗誤差，這是篩選工業生產菌株時常見的情況。因為真正的高產菌株，往往需要經過產量提高的逐步累積過程，才能變得越來越明顯。聽以有必要多挑選一些出發菌株進行多步育種，以確保挑選出高產菌株。反復誘變和篩選，將會提高篩選效率，可參考如下速度快、效果好的篩選步驟：①將出發菌株誘變處理：②平板分離200株單孢子菌株；③搖瓶初篩挑50株高產菌株；④搖瓶復篩挑5株高產菌株為下一輪的出發菌株；⑤將5株出發菌株誘變處理；⑥平板分離各出發菌株，各挑40菌株（共200株）；⑦再次采用初篩挑50株，復篩挑5株的同樣方式進行誘變和篩選。

　　2．突變的誘發

　　突變的誘發受到菌種的遺傳特性、誘變劑、菌種的生理狀態以及誘變處理時環境條件的影響。

　　(1)出發菌株出發菌株就是用來進行誘變試驗的菌株。出發菌株的選擇是誘變育種工作成敗的關鍵。出發菌株的性能，如菌種的純一性、菌種系譜、菌種的形態、生理、保存等特性，對誘變效果影響很大。挑選出發菌株有如下幾點經驗。①選擇純種作為出發菌株；②選擇遺傳特性好的菌株作為出發菌株；③選擇對誘變劑敏感的菌株作為出發菌株。

　　(2)誘變劑的選擇選擇誘變劑主要是根據已經成功的經驗。誘變作用不但決定于誘變劑，還與出發菌株的遺傳背景有關。一般對于遺傳上不穩定的菌株，可采用溫和的誘變劑。或采用已見效果的誘變劑；對于遺傳上較穩定的菌株則采用強烈的、不常用的、誘變譜廣的誘變劑。要重視出發菌株的誘變系譜。不要經常采用同一種誘變劑反復處理，以防止誘變效應飽和；但也不要頻頻變換誘變劑，以避免造成菌種的遺傳背景復雜，不利于高產菌株的穩定。

　　選擇誘變劑時，還應該考慮誘變劑本身的特點。例如紫外線主要作用于DNA分子的嘧啶堿基。而亞硝酸則主要作用于DNA分子嘌呤堿基。紫外線和亞硝酸復合使用，突變譜寬、誘變效果好。

　　關于誘變劑的最適劑量，有人主張采用致死率較高的劑量，例如采用90%~99.9%致死率的劑量，認為高劑量雖然負變株多，但變異幅度大；也有人主張采用中等劑量，例如致死率75%～80%或更低的劑量，認為這種劑量不會導致太多的負變株和形態突變株，因而高產菌株出現率較高。更為重要的是，采用低劑量誘變劑可能更有利于高產菌株的穩定。

　　(3)影響誘變效果的因素除了出發菌株的遺傳特性和誘變劑會影響誘變效果之外，菌種的生理狀態、被處理菌株誘變前的預培養和誘變后的培養條件以及誘變處理時的外界條件等都會影響誘變效果。

　　菌種的生理狀態與誘變效果有密切關系，例如堿基類似物、亞硝基胍(NTG)等只對分裂中的DNA有效，對靜止的或休眠的孢子或細胞無效；而另外一些誘變劑，如紫外線、亞硝酸、烷化劑、電離輻射等能直接與DNA起反應，因此對靜止的細胞也有誘變效應，但是對分裂中的細胞更有效。因此，放線菌、真菌的孢子在誘變前稍加萌發可以提高誘變率。

　　誘變處理前后的培養條件對誘變效果有明顯的影響�？捎幸獾赜谂囵B基中添加某些物質（如核酸堿基、咖啡因、氨基酸、氯化鋰、重金屬離子等）來影響細胞對DNA損傷的修復作用，使之出現更多的差錯，而達到提高誘變率的目的。例如菌種在紫外線前，在富有核酸堿基的培養基中培養，能增加其對紫外線的敏感。相反，如果菌種在進行紫外線處理以前，培養于含有氯霉素（或缺乏色氨酸）的培養基中，則會降低突變率。紫外線誘變處理后，將孢子液分離于富有氨基酸的培養基中，則有利于菌種發生突變誘變率還受到其他外界條件，例如溫度、氧氣、pH、可見光等的影響。

　　3．突變株的篩選

　　菌體細胞經誘變劑處理后，要從大量的變異菌株中，把一些具有優良性狀的突變株挑選出來，這需要有明確的篩選目標和篩選方法，需要進行認真細致的篩選工作，育種工作中常采用隨機篩選和理性化篩選這兩種篩選方法。

　　(1)隨機篩選隨機篩選即菌種經誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，從中篩選高產菌株。為了提高篩選效率，常采用下列方法：

　�、贀u瓶篩選法：搖瓶篩選的優點是培養條件與生產培養條件相接近，但工作量大、時間長、操作復雜。

　�、诃傊瑝K篩選法：這是一種簡便、迅速的初篩方法。將單菌落連同其生長培養基（瓊指塊）用打孔器取出，培養一段時間后，置于鑒定平板以測定其發酵產量。瓊脂塊篩選法的優點是操作簡便、速度快。但是，固體培養條件和液體培養條件之間是有差異的，利用此法所取得的初篩結果，必須經搖瓶復篩驗證。

　　③篩選自動化和篩選工具微型化：近年來，在研究篩選自動化方面有很大進展，篩選實驗室實現了自動化和半自動化，大大提高了篩選效率。篩選工具的微型化也是很有意義的，例如將一些小瓶子取代現有的發酵搖瓶，在固定框架中振蕩培養，可使操作簡便，又可加大篩選量。但篩選工具微型化實驗結果的準確性還有待提高。

　　(2)理性化篩選理性化篩選是運用遺傳學、生物化學的原理，根據產物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調控機制和產物分子結構來進行設計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調控機制，獲得能大量形成發酵產物的高產突變株。

　　要使微生物大量地積累初級代謝產物，最重要的是需打破反饋抑制調節。降低終產物濃度和抗反饋突變的育種是打破反饋抵制調節的重要措施。

　�、俳档徒K產物濃度：降低終產物濃度有兩種方法可以達到此目的：A．選育終產物的營養缺陷型菌株，在培養基中供給限量的終產物使該菌株能生長，但不致造成反饋調節，因而積累大量中間代謝產物。B.篩選細胞膜透性改變的突變株，使之大量分泌終產物，以降低細胞內終產物濃度，從而避免終產物反饋調節。

　　②篩選抗反饋突變菌株

　　A．篩選結構類似物（抗代謝物）抗性突變株：分離抗反饋突變菌株最常用的方法是用與代謝產物結構類似的化合物（結構類似物）處理微生物細胞群體，殺死或抑制絕大多數菌體細胞，選出能大量產生該代謝物的抗反饋突變株。結構類似物一方面具有和代謝物相似的結構，因而具有和代謝物相似的反饋調節作用，阻礙該代謝物的生成；另～方面它不同于代謝物，不具有正常的生理功能，對菌體細胞的正常代謝有阻礙作用，會抑制菌的生長或導致菌的死亡。

　　B．利用回復突變篩選抗反饋突變菌株：經誘變處理出發菌株，先選出對產物敏感的營養缺諂型，再將營養缺陷型進行第二次誘變處理得到回復突變株。篩選的目的不是要獲得完全回復原狀的回復突變株，而是希望經過兩次誘發突變，所得的回復突變株有可能改變了產物合成酶調節位點的氨基酸的順序，使之不能和產物結合，因而不受產物的反饋抑制。

　　4．突變基因的表達

　　菌種的發酵產量決定于菌種的遺傳特性和菌種的培養條件。突變株的遺傳特性改變了，其培養條件也應該做出相應的改變。在菌種選育過程的每個階段，都需不斷改進培養基和培養條件。以鑒別帶有新特點的突變株，尋找符合生產上某些特殊要求的菌株。高產菌株被篩選出來以后，要進行最佳發酵條件的研究，使高產基因能在生產規模條件下得以表現。

　　5．誘變育種實例

　　在白酒工業中廣為應用的黑曲霉UV-11菌株及其進一步變異株，就是將野生菌株202經紫外線、鈷60和亞硝基胍以及高能電子進行反復交替誘變而得到的。有人將臺灣根霉R13-5連續地用紫外線及MNNG進行處理，得到了一株溫度敏感型變異株，用麩皮為原料進行固態培養，其產糖化酶活力比親株高5～7倍，若采用深層液態培養法，則酶活力比親株高15倍。若以紫外線等因子處理白酒生產用的糖化菌，其變異可提高耐單寧及分解單寧的能力。

　　現以酵母菌株為例。

　　(1)平板分離培養基酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，玫瑰紅0.003%，丙酸0. 19%，瓊脂2%。

　　(2)原菌誘變將原菌稀釋培養于培養皿中，置于20W紫外燈下30cm處照射25s，能引起原菌較好的變異，挑取典型菌落進行發酵實驗，最后選得2株菌種。

　　(3)馴化

　�、僦苯玉Z化：將上述2株菌種分別接人酒精度為6%~9%的麥芽汁培養基中，于30℃培養48h，比較酵母的存活率，反復轉接至存活率相近。再經YPDI培養基平板分離，選出較理想的菌株。

　　②將濃醪發酵菌株繼續馴化：將誘變所得2株菌種進行濃醪發酵，酒精濃度為13%，取該發酵醪少許，接入酒精濃度8%的麥芽汁中培養24h，經YPDI培養基分離，挑選若干典型菌落，進行3次發酵對比試驗，最后得到2株較理想的菌株。

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